蛋白亚型表达的原因：一种蛋白有时检测压型很明显,有时不是很明显.参考了很多文献的结果,均有此种情况出现,即使是大家都觉得很确定的蛋白很多时候也会出现不同的亚型.毕竟对很多蛋白我们的认识有限.这种情况不要怕的,尽管按照真实结果去处理,千万不要为了让结果好看或者符合大家的意思而去做修改.
如果样品量充分， 可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。
附：在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
至少预实验的时候建议做蛋白定量。虽然蛋白定量主要目的是对样品进行均一化处理，保证上样量一致。但是另一个作用优化上样量，也十分重要。上样量太低，目标蛋白可能检测不到；上样量太高有可能导致过曝，灰度值分析误差大。有文献报道总蛋白上样量超过10ug/孔时内参蛋白不够敏感，无法检测到差异。内参蛋白理想的上样量5ug以内，目标蛋白的上样量为10-20ug。
Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，「探针」是抗体，「显色」用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
初学者可以模仿文献里面的图片，也就是将模式图复制到 AI 的画布上，调整透明度，并锁住该图层，新建图层来模仿，模仿可以是模式图中的某个元件「比如细胞核，蛋白，核酸等」，然后保存这些元件，在之后需要时直接复制这些元件。当然也可以自己用 AI 画出想要的元件及模式图。
如果是本来就有正确结构的蛋白是不需要加DTT的，如果是变性的蛋白，并且其一级结构中含半胱氨酸，那么缓冲液中加DTT，并且逐渐减少DTT浓度。DTT是防止错误的二硫桥形成的，蛋白会先向正确结构形成二硫键，但是这个过程较为缓慢，如果直接不加还原剂，那么正确的和错误的二硫键都会形成。所以慢慢的降低DTT，使蛋白形成正确的结构而不至于形成错误的二硫键。
Tags:
Wb,
mortal,
kombat,
x,
хиты,
playstation,
